+7 (495) 212-15-31
 

Лазерная корреляционная спектроскопия noname

в изучении биологических нанообъектов.

Метод лазерной корреляционной спектроскопии обладает рядом существенных достоинств:

-  время измерения – минуты;

-  проведение анализа в среде обитания биообъекта,

-  получение статистических характеристик  штамма.

уникальные возможности метода:

- особность обнаруживать весьма малые изменения исследуемого объекта при сравнении спектров света, рассеянного образцом до и после изменения условий;

-  максимальная достоверность полученной информации о характере происшедших в изучаемой системе изменений т.к. в процессе измерений состояние образца не меняется под действием внешних факторов присущих основным методам исследования биообъектов, таким как хроматография, седиментация, биохимические и т.д. которые  меняют состояние образца.

Исследование живых биологических объектов, например, вирусов связано с рядом трудностей. В процессе подготовки образцов возможна модификация объектов. При электронно-микроскопическом исследовании невозможно работать с “живым “ вирусом, его фиксируют и покрывают осаждаемым на поверхность коллоидным золотом, причем поток электронов губителен для живых микроорганизмов. При исследовании с помощью атомно-силового микроскопа (АСМ)  идет изучение “живого” вируса, “распластанного”  по подложке с фиксирующим агентом. При этом трудно оценить статистические характеристики вирусных линий. В силу высокой мутабельности ряда вирусов, в частности ВИЧ, статистические характеристики - средний размер и дисперсия размеров, играют важную роль для метрологической идентификации и паспортизации культуральных штаммов вируса [1,2].

Размер вириона является ключевым критерием для его надлежащей классификации и имеет определяющее значение для многих практических приложений. Размер, определенный с помощью электронной микроскопии, имеет погрешность за счет аберраций - более чем на 10%. Ошибки при определении размера могут возникнуть и из-за препаративной неточности, например, усадки образца или припухлости, а также и инструментальной ошибки, связанной с трудностями калибровки в наномасштабе длин. В работе [3] определили диаметры зрелых и незрелых ВИЧ-1 в диапазоне от 110 до 128 и 132 до 146 нм, соответственно.

Метод нанотехнологий - лазерная корреляционная спектроскопия обладает рядом достоинств и уникальных возможностей.

Основные достоинства метода:

- метод позволят напрямую, in vitro, проводить эксперименты по воздействию на живые вирусы различными факторами. При этом вирус не модифицируется и остается живым так как исследования проводятся в  среде обитания биообъекта;

В настоящей  работе представлен краткий обзор результатов исследований наноразмерных биообъектов с использованием спектрометрии динамически рассеянного света.

Исследования проводились в ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» РАМН, Москва, под руководством д.б.н. профессора Иванова А.В.; в Московском государственном университете им. Ломоносова, Москва, под руководством к.ф-м.н. доцента В.Н. Никифорова; в ООО «КБ Наука», г.Арзамас, под руководством                 С.Е. Виноградова. Исследования проводились с использованием ряда лазерных спектрометров динамического рассеяния света КУРС (Рисунок 1),  разработанных под руководством к.ф-м.н. Певгова В.Г. – Московский физико-технический институт.

 

Исследование вирусов ВИЧ и гепатита А

Вирус иммунодефицита человека независимо открыли в 1983 году в двух лабораториях - в Институте Пастера во Франции под руководством Люка Монтанье, и в Национальном институте рака в США под руководством Роберта Галло. Вирус HTLV-3 Галло и вирус LAV Монтанье - это один и тот же вирус -  вирус иммунодефицита человека (ВИЧ).  Вирус иммунодефицита человека, уже более 25 лет, привлекает внимание исследователей [4]. Подвергавшееся вначале сомнению само существование вируса, вскоре сменилось огромным шквалом различных исследований. Проводились не только электронно-микроскопические исследования (см. Рис. 5), но и атомно-силовая микроскопия (АСМ) [5,6], а также масс-спектрометрические исследования [6]. Вирус ВИЧ, как было определено, имеет икосаэдрическую симметрию, и близок  к эллипсоидальной форме (Рис. 5, любезно предоставлен авторам). Диаметр вируса по порядку величины  составляет 10-7 м, и  близок  к 70 - 120 нанометрам.

Размер вируса ВИЧ имеет важное самостоятельное значение. Это не просто еще один измеряемый параметр вируса, это отличительный метрологический признак и характеристика, важный как для идентификации вируса ВИЧ, так и для характеристики штамма вируса. Поскольку “обезвреженный” вирус ВИЧ планируется использовать для генной доставки, проблемы паспортизации и метрологического контроля становятся актуальными.

  

Образцы для исследования

Штаммы вируса

В работе были использованы для сравнительного анализа разные по размерам вирусы: культуральный штамм вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) H9/IIIB и  культуральный вакцинный штамм вируса гепатита А (ВГА) ИВА.

Клеточные линии

Для размножения ВИЧ in vitro использовали перевиваемую линию клеток  МТ-2-Т-лимфоциты человека, а для размножения ВГА линию ВНК-21 (с 13) – клетки почки эмбриона сирийского хомячка. Линии были получены из коллекций клеточных культур: ATCC  (Американская коллекция клеточных культур),  Института цитологии РАН (Санкт-Петербург) и Института вирусологии РАМН (Москва).

Среда размещения исследуемого объекта

Перед началом измерений исследуется растворитель или среда размещения исследуемого объекта т.к. для оптических экспериментов вопрос подготовки образца к исследованиям имеет первостепенное значение

В эксперименте в качестве среды размещения вирусов использовался фосфатно-солевой буфер Дюльбеко (DPBS). Результаты исследования приведены на рисунке 2.

 

 

 

Слева на рисунке 2 показан результат измерения буфера, приобретённого в аптеке, изготовленного на специализированном предприятии. Справа – буфер приготовленный в лабораторных условиях (традиционно). 

Как видим, результаты исследований двух буферов разительно отличаются друг от друга.

В лабораторном буфере мы наблюдаем достаточно большое количество (около35% по массе) объектов с размером 150 – 170 нм и 900 – 1100 нм, в то время как в аптечном буфере -  зона от 0 до 1000 нм совершенно чистая. Хотя, при применении процедуры регуляризации, результат исследования при наличии посторонних объектов не искажается, точность определения параметров изучаемого объекта уменьшается по мере роста вклада посторонних примесей, соответственно, сильно усложняется анализ полученных результатов. Присутствие крупных объектов с характерными размерами от единиц до десятков микрометров объясняется присутствием единичных частиц пыли в растворе появляющихся как в процессе подготовки объекта, так и, собственно, в процессе измерения. Но поскольку массовая концентрация пыли существенно меньше массовой концентрации исследуемого объекта, а размер – больше, то соответственно коэффициент диффузии от пыли меньше и вклад в рассеяние на ней присутствует в низкочастотной части полученного спектра сигнала от рассеянного излучения.

Гепатит А

Для проверки достоверности получаемых результатов первым объектом исследований был культуральный вакцинный штамм вируса гепатита А (ВГА), размер которого хорошо известен D=27 nm. На рисунке 3 показан результат измерения методом ЛКС, на рисунке 4 - снимок с электронного микроскопа. Как видим, результаты, полученные обоими методами очень хорошо коррелируют между собой. Оба метода позволяют обнаруживать изучаемый объект (на рисунках отмечен цифрой 1) и наличие его конгломератов.

 

 

ВИЧ

Вирус иммунодефицита человека, уже более 25 лет, привлекает внимание исследователей. Вирус ВИЧ, как было определено, имеет икосаэдрическую симметрию, и близок  к эллипсоидальной форме (Рис. 5). Диаметр вируса близок  к 70 - 120 нанометрам.

Авторам удалось провести электронно-микроскопические исследования вируса ВИЧ, исследования вируса ВИЧ на атомно-силовом микроскопе JPK Nanowizard, а также впервые были проведены исследования вируса ВИЧ методом ЛКС (рис 6 – 8). В работе был использован культуральный штамм вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) H9/IIIB.

 

 

 

Таким образом, полученные результаты сравнительных исследований вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и гепатита А методами АСМ, ЛКС и ЭМ хорошо коррелируют друг с другом.

 

Определение параметров наноструктур на основе иттербиевого комплекса 2, 4-диметоксигематопорфирина и их коньюгатов  с БСА методом ЛКС.

Большой интерес к иттербиевому комплексу 2, 4-диметоксигематопорфирина IX (ИКДГ) обусловлен тем, что он обладает уникальными спектрально-люминесцентными характеристиками:

- высоким коэффициентом экстинкции (1,5х105 М-1 см-1);

- большим временем жизни люминесценции (более 10 μs);

- люминесцентным сигналом повышенной интенсивности в ИК-области спектра (900-1100нм), что позволяет детектировать данную субстанцию в растворах при концентрациях порядка 10-8 M и менее;

- значительным (>250нм) разнесением полос возбуждения и регистрации люминесценции;

- квантовым выходом >1%.

Кроме того, эта субстанция принадлежит к натуральным порфиринам и, следовательно, мало токсична.

Поэтому в настоящее время ведутся интенсивные работы по использованию данного соединения для люминесцентной диагностики (ЛД) визуально и  эндоскопически доступных форм рака в качестве чисто диагностического малотоксичного фотосенсибилизатора (МФС).

ИКДГ востребован также и в тераностике - новом тренде современной нанобиотехнологии.

Данное направление подразумевает создание многофункциональных наноструктур, которые совмещают терапевтические и диагностические свойства в одной частице, в связи с чем, становится возможным проведение люминесцентной диагностики с последующей лазерной термодеструкцией опухолей (в том числе с помощью плазмонного резонанса) [7]. Следует также отметить, что введение иона иттербия в порфирин приводит к снижению фотохимической активности фотосенсибилизатора [8], сохраняя при этом свойственную большинству порфиринов тропность к злокачественным опухолям.

Способность порфиринов и их металлокомплексов накапливаться в злокачественных опухолях лежит в основе фотодинамической терапии и ЛД онкологических заболеваний. Избирательность доставки порфиринов в раковые клетки увеличивается при использовании коньюгатов металлокомплексов порфиринов (МКП) с сывороточными альбуминами [9]. Альбумин плазмы крови является одним из главных транспортных белков в организме.

Следует также отметить, что в плазме крови вторыми после альбумина эндогенными носителями являются  липопротеины, которые, как известно [10], служат транспортерами для относительно гидрофобных лекарственных форм. Липопротеины очень привлекательны для транспортной  доставки лекарств к опухолевым клеткам, имеющим большое количество липопротеиновых рецепторов. Это приводит к большой селективности накопления липопротеинов по сравнению с нормальными клетками. Все это и объясняет, почему амфифильные МКП имеют существенно более высокую селективность накопления в опухолях. Однако известно, что селективность накопления в опухоли в значительной степени зависит от размеров субстанций. В ряде работ [11, 12], было показано, что зависимость накопления наночастиц  (таких как липосомы, ФС «Тиосенс» и т. д.) от их диаметра имеет немонотонный характер с максимумом 75-130нм (размер, близкий дефектам эндотелиального слоя новообразованных «дырявых» сосудов опухоли: 100-200нм)).  С другой стороны, чем меньше размер наночастиц, тем меньше вероятность захвата их ретикуло-эндотелиальной системой живого организма, и тем больше время их циркуляции в крови. В связи с этим определение параметров размерности лекарственных веществ и их коньюгатов с альбумином является актуальной задачей.

Высокое значение селективности накопления данных субстанций может быть связано с размерностью данных комплексов. Измерения на установке ЛАК-1 показали, что более 95% от общего количества субстанции имеют размер около 5нм, что составляет примерно половину от размера молекулы сывороточного альбумина (9нм) [Алехин и др. Ж. Российские нанотехнологии, Т.5, №9-10], что подтверждается измерениями, проведёнными  на лазерном спектрометре динамического рассеяния света КУРС – 3 (Рисунок 9 б). В работе  [Ferrer M. L. Et al. J. Biophys., v. 80, 2001, p.2422-30] было показано, что размер мономера дейтеропорфирина по оси:  CH3-порфириновое кольцо-CH2-CH2-COOH составляет 1,4 нм. Размер молекулы  ИКДГ несколько больше молекулы дейтеропорфирина и может быть примерно оценен величиной около 2нм. Таким образом, можно заключить, что в растворе  ИКДГ в основном присутствует в форме димера (Рисунок 9 а).

Используя возможность метода ЛКС обнаруживать весьма малые изменения исследуемого объекта при сравнении спектров света, рассеянного образцом до и после изменения условий, авторами были проведены исследования образования коньюгата ИКДГ/БСА (Рисунок 9 в, г).

 

Рисунок 9. Гистограммы распределения по размерам полученные с помощью лазерного спектрометра динамического рассеяния света КУРС – 3. (а – иттербиевый комплекс 2, 4-диметоксигематопорфирин; б – бычий сывороточный альбумин (БСА);  в - комплекс ИКДГ с БСА через 55 минут, г - комплекс ИКДГ с БСА через 24 часа).  

 

Таким образом, средний размер коньюгата составляет 20-30нм.

Как было показано в работе [Г. Е. Добрецов, Т. И. Сырейщикова, Ю. А. Грызунов,      Н. В. Смолина, А. А. Комар. Ж. Биофизика. Т. 55, Вып. 2. С. 213-219. 2010],  суммарное количество специальных центров в молекуле альбумина, способных связывать многие типы лекарств и красителей, составляет не менее 2 единиц. В результате средний размер коньюгата, измеренный ЛКС - методом, совпадает с расчетными данными теоретических исследований (9нм+5нм+5нм=19нм). Коньюгаты ИКДГ/БСА (средний размер 20-30нм), имеют высокую селективность накопления в опухоли, которую мы связываем с их размерностью (большое время циркуляции в кровотоке), а также амфифильностью ИКДГ (попадание в ткани опухоли благодаря липопротеинам). 

Результаты эксперимента образования коньюгата ИКДГ/БСА методом ЛКС убедительно показывают перспективность данного метода в изучении динамики изменения исследуемых биообъектов.

 

Список литературы

 

1. T.Sakaguchi, T.Uchiyama,C. Huang et al. Alteration of Sendai Virus Morphogenesis and Nucleocapsid Incorporation due to Mutation of Cysteine Residues of the Matrix Protein, J Virol., 2002,  v.76(4): p.1682.

2. S.E. Aniagyei, C.J. Kennedy, B. Stein et al. Synergistic Effects of Mutations and Nanoparticle Templating in the Self-Assembly of Cowpea Chlorotic Mottle Virus Capsids. Nano Letters, 2009, v.9 (1), p. 39.

3. M.Gentile, T.Adrian, A.Scheidler et al. Determination of the size of HIV using adenovirus type 2 as an internal length marker. J Virol Methods. 1994 , 48(1), p.43.

4. C Flexner. HIV drug development: the next 25 years. Nature Reviews Drug Discovery, 2007, v. 6, p.941.

5. Y.G.Kuznetsov, J.G.Victoria, W.E.Robinson, A.McPherson. Atomic force microscopy investigation of HIV and HIV-infected lymphocytes. Journal of Virology, 2003, p.11896.

6.A. Galkin, E. Filinova, V.Nikiforov et al. Mass spectrometry analysis of HIV-1 envelop proteins. Retrovirology 2009, 6 (Suppl 2), p.37

7. Khlebtsov, E. Panfilova, V. Khanadeev, O. Bibikova, G. Terentyuk, A. Ivanov,                V. Rumyantseva, I. Shilov, A. Ryabova, V. Loshchenov, N. Khlebtsov.“Nanocomposites containing silica-coated gold-silver nanocages and Yb-2,4-dimethoxyhematoporphyrin: multifunctional capability of IR-luminescence detection, photosensitization and photothermolysis”. J. ACS Nano, Vol. 5, No. 9, P. 7077-7089. 2011. Copyright: American Chemical Society

8. Румянцева В. Д., Миронов А. Ф., Щамхалов К. С., Сухин Г. М., Шилов И. П., Маркушев В. М., . Кузьмина З. В., Полянская Н. И., Иванов А. В.

Иттербиевые комплексы порфиринов - перспективные маркеры для люминесцентной диагностики опухолей в ИК-диапазоне. Ж. Лазерная медицина. Т. 14. Вып. 1. С. 20-25. 2010

9. Padmaja P. Mishra, Sunita Patel, Anindya Datta. J. Phys. Chem. B., 110, 21238, (2006).

10. Bardos-Nagy I., Galantai R., Fidy J. J. Biochim. Biophys. Acta., 1512, 125, (2001)

11.  O. Ishida et al//Int. J. Pharmaceut. 1999. V.190. No.1. P. 49

12. И. Г. Меерович, Г. А. Меерович, А. Ю. Барышников et al. Мат-лы конф. Роснанотех.-2008